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高效液相色譜法測定诃子中鞣花酸的含量
作者:加拿大超级联赛生物            发布时间:2020-08-27
  摘要:诃子又名诃黎、诃黎勒、隨風子,爲使君子科植物的果實。诃子作爲中藥在中醫臨床上廣泛使用,用于油脂抗氧化方面的研究在國內已見有專門報道。诃子果實中含豐富的鞣質和多元酚類,約爲30%~40%已有文獻報道,鞣質和多元酚類具有較好的抗氧化性。

目的建立诃子提取物中鞣花酸含量的高效液相色譜(HPLC)測定方法。方法色譜條件Shim-packCLC-ODS色譜柱(150mm×6mm,5μm),柱溫30℃,用CH3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4(0.05mol/L)(體積比30∶2∶68)作爲流動相,檢測波長爲254nm。結果鞣花酸在0.268~5.36μg範圍內與峰面積呈良好的線性關系。平均加樣回收率爲98.42%,RSD爲1.13%(n=5)。結論該方法快速、簡便、准確,可用于诃子中鞣花酸的含量測定。

【關鍵詞】诃子;鞣花酸;高效液相色譜

鞣花酸(2,3,7,8-tetrahydroxybenzopyrano[5,4,3-cde]benzopyran-5,10-dione)是一種植物多酚類化合物[5](如圖1),爲诃子中主要的活性成分之一,廣泛存在于各種自然的軟果、堅果等植物果實中。它對化學物質誘導癌變及其他多種癌變有明顯的抑制作用,它能與人體內有害自由基結合,具有強力祛癌變功效,可以抗衰老、增加機體免疫,還具有降壓、鎮靜作用,對多種細菌、病毒有很好的抑制作用[6]。因此鞣花酸有“克癌之星”“致癌物清除劑”之美稱。從機理上講,鞣花酸是一種抗氧化劑[7],它可作爲保健食品添加劑,研究、開發本品具有較高的經濟價值和廣泛的應用範圍。

本實驗建立了HPLC法測定诃子中鞣花酸含量的方法,並對文獻報道的多種色譜條件進行了比較[8~10],表明本文方法精確可行。

1儀器與試劑

日本島津SPD-10AT高效液相色譜儀;SPD-10Avp檢測器;SIL-10AP自動進樣器;超純水器(arium611UF,Sartorius);超聲波清洗器(AS3120A,天津瑞森特);電子天平(AdventurerTM,AR2140,上海奧豪斯公司);旋轉蒸發儀(R-200,瑞士Buchi)。島津UV2100型,甲醇爲色譜純;實驗用水爲超純水,蒸餾水自制,其它試劑均爲國産分析純試劑。

鞣花酸對照品(購自購自成都普瑞法科技開發有限公司),純度≥98%。诃子(産自雲南臨倉和緬甸)。

2方法

2.1色譜條件色譜柱爲島津Shim-packCLC-ODS柱(150mm×6mm,5μm),柱溫30℃,用CH3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4(0.05mol/L)(體積比34∶2∶64)作爲流動相,檢測波長爲254nm。

2.2對照品溶液的制備精密稱取鞣花酸對照品6.7mg,加甲醇25ml制成每毫升含0.268mg的對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備精密稱取诃子粉(均過60目篩)約1g,置于100ml具塞三角燒瓶中,加60%乙醇25ml,超聲提取60min,過濾,用60%洗滌濾渣,合並濾液和洗滌液,50℃旋轉蒸幹,加甲醇定容至10ml,以0.45μm微孔濾膜濾過,濾液作爲樣品供試液,進樣10μl。

2.4标准曲线制备精密吸取对照品溶液1.0,2.0,5.0,10.0,15.0,20.0μl进样,测定峰面积,并以色谱峰峰面积(A)对对照品的量(m)回归(包括原点),得回归方程为A=7.5777E 06m 9.6700E 05(R=0.9999)。鞣花酸0.268~5.36μg范围内,线性关系良好。

2.5精密度和樣品重複性實驗重複進對照品溶液10μl/次,測得鞣花酸峰面積相對標准偏差RSD=0.9%(n=6);對同一樣品按擬定的方法作多次測定,其含量相對標准偏差RSD=2.1%(n=5)。

a-鞣花酸對照品b-诃子樣品

2.6回收率實驗采用加樣回收法取已知量的诃子,分別添加一定量的鞣花酸對照品,按擬定的方法測定,結果平均回收率爲98.42%,RSD爲1.13%(n=5)。

2.7樣品測定按上述“2.3”項樣品液制備方法測定雲南産诃子和緬甸産诃子中鞣花酸的含量,雲南産诃子和緬甸産诃子的鞣花酸含量分別爲0.573mg/g(RSD=3.4%)和0.567mg/g(RSD=4.2%)。

3結果

3.1最佳檢測波長的選擇對鞣花酸對照品甲醇溶液的紫外-可見光(200~600nm)掃描發現,鞣花酸在254nm有最大吸收,故選擇254nm爲其檢測波長。

3.2流動相的選擇實驗發現,若僅用甲醇和水作流動相,很難實現多酚物質的分離。通過改變流動相的pH值來提高分離度,由于pH太低會損壞色譜柱,導致柱效降低。本實驗選用磷酸和磷酸鹽緩沖體系,醋酸乙酯和甲醇作流動相,流動相中加入了一定量的磷酸,對鞣花酸起離子抑制作用,使其與雜質峰達到很好地分離。

3.3流速對分離度的影響在一定流速範圍內,流速減少,柱效提高,分離度變大。但若流速過慢,分析時間延長,縱向擴散的影響變大,柱效降低。雖然提高流速可縮短分析時間,但若流速過高,物質來不及分離就被洗出,分離效果差,而且會損壞泵頭和色譜柱。因此,流速對分離度的影響也很大。最終確定流速爲1.0ml·min-1時,出峰時間和分離效果均較滿意。

4結論

本法操作簡單,結果准確,重複性好,可作爲該産品的質量控制方法。由于诃子提取物具有良好的藥用價值,對多個系統疾病具有良好的治療作用,具有較好的開發前景。本研究采用HPLC法測定诃子中鞣花酸含量,方法快速、簡便、准確,測定結果可靠,爲诃子在食品開發及醫藥應用上提供科學依據。


(來源:中國化工儀器網)

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